Teste molecular no diagnóstico do novo Coronavírus, entenda:

por | jun 12, 2020

No atual cenário pandêmico, com o novo coronavírus (COVID-19), a sociedade cientifica como um todo se encontra numa busca incansável por soluções para essa nova infecção viral. Tais pesquisas variam desde estudos sobre novas formas de tratamento ao desenvolvimento de vacinas e testes para diagnóstico rápido. Assim, a Biologia Molecular é uma das principais ferramentas utilizadas pelos cientistas do mundo todo, tendo em vista que o principal teste para diagnóstico da doença desenvolvido até hoje, trata-se de um teste molecular. A RT-qPCR é uma tecnologia que tem sido comentada diariamente, mas você sabe o que é uma RT-qPCR? O que ela difere da PCR? Onde ela pode ser aplicada? E, como o teste molecular do novo coronavírus é feito?

O que é uma PCR, uma RT-PCR e no que se diferem?

A PCR ou reação em cadeia da polimerase criada em 1983 por Kary Mullis, trata-se de uma técnica pela qual, as moléculas de DNA são amplificadas (in vitro) milhares ou milhões de vezes, de forma rápida e eficiente. Por tais características, essa técnica tornou-se a pedra angular da biologia molecular moderna em todo o mundo. Sendo rigorosamente sensível, permite à amplificação de DNA a partir de mínimas quantidades de amostra.

Tal como a replicação de DNA de um organismo, a PCR também exige uma enzima DNA polimerase que possa gerar novas fitas de DNA, a partir da fita molde. Sendo assim, foi descoberta a enzima Taq polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, organismo que habita fontes termais tendo a maioria de suas enzimas termoestáveis, ou seja, suportam altas temperaturas e não tem a perda de funcionalidade de suas enzimas. Durante o procedimento a elevação da temperatura é parte fundamental para bom êxito da PCR, temperatura essa que pode chegar a ser maior que 90°C.

De maneira análoga, a PCR consiste em três etapas básicas (figura 1):

1º Desnaturação: a reação é aquecida a uma temperatura de aproximadamente 96° C, para desnaturação das fitas de DNA. Gerando moldes de fitas simples para a próxima etapa.

2º Anelamento: é feito o resfriamento da reação para que possa haver a ligação dos primers (sequências curtas de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA), às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.

3° Extensão: a temperatura é novamente elevada até 72°C no intuito de que a Taq polimerase estenda os primers e sintetize novas fitas de DNA.

Figura 1: etapas de uma PCR.

Com o passar dos anos, avanços importantes foram obtidos para melhoramento e aperfeiçoamento da PCR, um deles foi a criação da Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa em tempo real (RT-qPCR). Seu principal diferencial em relação a PCR convencional, é não partir de um molde de DNA extraído diretamente da amostra. Primeiramente, a amostra fornece seu mRNA, entretanto, o mRNA não é viável para a continuidade do procedimento por sua sensibilidade a vários fatores e à altas temperaturas. Dessa forma, a Transcriptase Reversa, enzima responsável por realizar um processo de transcrição reversa (polimerizar moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA), é usada para converter o mRNA amostral em cDNA, que será utilizado na qPCR.

Na etapa de qPCR ocorre então, a amplificação de um sítio específico no conjunto de cDNA com a utilização da Taq polimerase, são adicionados também oligômeros específicos que servem como primers e um fluoróforo, que emitirá luz. Ao longo dos ciclos da PCR no termociclador (equipamento utilizado para o procedimento), o fluoróforo liga-se as cadeias duplas de cDNA, sintetizado pela Transcriptase Reversa, e emite luz proporcional a quantidade de cDNA presente na amostra. Sendo assim, no monitor do equipamento, um gráfico vai sendo gerado em tempo real à medida que cada ciclo se completa. Ao final da técnica é possível fazer a análise do gráfico e quantificar a amostra inicial.

 

Como o teste para diagnóstico do novo coronavírus é feito?

O teste molecular RT-qPCR é considerado hoje o padrão-ouro para diagnóstico de infecção pelo novo coronavírus, para realização da técnica é necessário a coleta do material de amostra (RNA viral) através de um swab da cavidade nasal e orofaringe. Até o momento, o teste continua sendo o referencial para a confirmação exata de pacientes sintomáticos em fase aguda. É recomendado pelo Ministério da saúde, que para melhores resultados, o teste seja coletado entre o 3° e 7° dias a partir do início dos sintomas, isso porque a carga viral nesse intervalo de tempo é maior. Após o 7° dia a positividade da RT-qPCR pode cair drasticamente, podendo levar a um resultado de falso negativo. Outros fatores podem acarretar um resultado falso negativo, como:

  • Má qualidade da amostra coletada, por vezes contendo pouco material;
  • Amostra manuseada e enviada de maneira incorreta;
  • Razões técnicas inerentes ao teste, como manutenção do vírus ou inibição da PCR.

Depois de extraído, o material de análise segue para o procedimento da RT-qPCR, já descrito. Os equipamentos e métodos utilizados permitem que o teste seja finalizado em 3 horas, com isso o tempo de resposta aos suspeitos é agilizado.

Em casos de Síndrome Respiratória Aguda Grave (SRAG), é indicado aproveitar a amostra que já havia sido retirada do paciente, contendo o RNA viral, para investigar influenza e outros vírus emergentes.

Onde podem ser aplicada?

Além do teste para o novo coronavírus (COVID-19), a RT-qPCR é utilizada em inúmeros laboratórios de pesquisa, genotipagem, validação de resultados de microarray, identificação de mutações pontuais, farmacogenética, além de ter papel importante no diagnóstico de doenças como a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Outras técnicas de PCR também podem ser usadas na ciência forense, testes genéticos, diagnóstico e outros. Isso mostra a excelência dessa tecnologia e sua importância para a saúde e a sociedade.

De fato, a ciência e a tecnologia vêm mostrando sua importância. Continuar na mesmice não é foco quando se fala em pesquisa e inovação; e a biologia molecular não fica atrás quando o assunto é inovar, tendo sempre como intuito a busca por melhorar, aperfeiçoar e descobrir.

 

 

Referências bibliográficas                                                                                         

https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf

LADEIRA, Pedro Ribeiro Soares de; ISAAC, Cesar; FERREIRA, Marcus Castro. “Reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real”. Revista de Medicina: São Paulo, 2011.

NASCIMENTO, Sabrina; SUAREZ, Eloah Rabello; PINHAL, Maria Aparecida da Silva. “Tecnologia de PCR e RT-PCR em tempo real e suas aplicações na área médica”.  Revista Brasileira de Medicina: São Paulo, 2010.

 

Autora: Camila Andresa Oliveira, graduanda em Bioquímica na Universidade Federal de São João del-Rei.

E-mail: camilaandresa12@gmail.com

 

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O movimento Bioquímica Brasil foi fundado em 2014 por egressos e estudantes dos cursos de Bioquímica.

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